Half Löwenstein-Jensen Foundation, voorbereiding en gebruik

Hij Middle Löwenstein-Jensen Het is een selectief vast medium voor de isolatie en ontwikkeling van bacteriën van het geslacht Mycobacterium, zoals Mycobacterium tuberculose, M. Avium, onder andere, met uitzondering van de soorten leprae, die niet te cultiveren is.

Bacteriën van het geslacht Mycobacterium groeien niet in conventionele kweekmedia, daarom was het noodzakelijk om een ​​speciaal middel voor het isolement te ontwerpen. Het originele medium is gemaakt door Löwenstein en werd vervolgens aangepast door Jensen.

Half Löwenstein-Jensen met kolonies van Mycobacterium tuberculose. Bron: Agarwal et al / Biomed Central Ltd., Met dank aan de Biology Image Library

De modificatie bestond uit de eliminatie van de Congo Red Dye, ter vervanging voor een grotere concentratie van Malachite Green. Het veranderde ook de concentraties van magnesiumcitraat en monopotasische fosfaat.

Het Löwenstein-Lose-medium bevat momenteel een pauselijk zetmeel, asparragine, magnetisch citraat, monopo-fase fosfaat, magnetisch sulfaat, malachietgroen, nalidíxicozuur, cycloheximid.

Mycobacteriën worden normaal gesproken geïsoleerd van locaties die niet steriel zijn, zoals sputum, urine, abcessen, onder andere. Dit betekent dat de meeste monsters de gebruikelijke microbiota van het gebied zullen bevatten, plus de ziekteverwekker.

Daarom bevat het Löwenstein-Jensen-medium een ​​reeks remmers in de samenstelling van Malachite Green, Antibiotics en Antifungals.

Bovendien moeten monsters die afkomstig zijn van een niet-steriele site worden ontsmet en geneutraliseerd voordat ze worden gezaaid in het medium Löwenstein-Jensen.

[TOC]

Basis

De aanwezigheid van ei en glycerine in het Löwenstein-Jensen-medium stimuleert de groei van mycobacteriën omdat ze vetzuren en eiwitten bieden die nodig zijn voor de ontwikkeling van deze micro-organismen.

Het Löwenstein-Jensen-medium bevat Malachite Green, een bijbehorende microbiota-remmer. Maar het bevat ook nalidíxxzuur (35 µg/ml), dat de gram negatieve microbiota, cycloheximide (400 µg/ml) remt, die saprofyten fungi en gisten remt, en lynchen (2 µ/ml), die de microbiota gram positieve positieve positieve positieve positieve positieve remmen.

Sommige commerciële huizen geven er de voorkeur aan om de volgende combinatie van antibiotica toe te voegen: Polymixina B 200.000 eenheden/L, amfotericine B 10 mg/l, carbenicilline 50 mg/l en trimetoprima 10 mg/l.

Dit medium bevat geen agar, daarom vindt de stolling van het medium plaats door de coagulatie van het albumine dat in het ei aanwezig is tijdens sterilisatie.

Voorbereiding

Weeg 37,3 g van het gedehydrateerde medium in 600 ml gedestilleerd water dat eerder 12 ml glycerol is toegevoegd. Het mengsel wordt verwarmd, vaak roeren tot zijn totale oplossing. Autoclavar Het medium gedurende 15 minuten bij 121 ° C.

Kan u van dienst zijn: de 12 fasen van de menselijke ontwikkeling en de kenmerken ervan

Aan de andere kant moet een homogene ophanging van 1000 ml verse eieren worden bereid in aseptische omstandigheden. Voeg de eierophanging toe bij 600 ml bereid bij een temperatuur van 50 - 60 ° C, waardoor luchtbellen worden vermeden.

Antibiotica -oplossingen worden ook toegevoegd na sterilisatie in autoclaaf.

Giet het medium in steriele testbuizen met een schroefdraadstekker. Verwarm de buizen 45 minuten op 85 ° C in hellende positie.

De kleur van het voorbereide medium is aguamarine groen en kan witachtige punten presenteren voor de aanwezigheid van ei -lipiden.

De middelgrote pH moet 7,2 ± 0,2 zijn

Bewaar de koelkastbuizen en beschermd tegen direct licht tot gebruik. Zinken voordat u zaait.

Er is een wijziging van het medium genaamd "Gruft Modification of the Löwenstein Jensen". Dit bevat dezelfde verbindingen als het klassieke medium maar RNA-5 mg/100 ml wordt toegevoegd, en als remmers bevat het malachietgroen 0,025 g/100 ml, penicilline 50 u/ml en nalidíxicico 35 ug/ml zuur.

Toepassingen

Het Löwenstein-Jensen-medium wordt gebruikt voor Mycobacteria-isolatie, van verschillende soorten monsters. Het wordt aanbevolen om een ​​Ziehl-Neelsen-kleuring uit te voeren naar elk monster waarin de aanwezigheid van Mycobacteria wordt vermoed.

Sommige monsters komen van steriele sites, maar anderen niet. Niet -steriele monsters moeten worden ontsmet, zoals het geval kan zijn:

Sputum

Sputummonsters moeten als volgt worden ontsmet: bepaal de hoeveelheid sputummonster in ml en voeg aan dezelfde hoeveelheid van 4% NaOH en incube toe aan 37 ° C.

Schud het mengsel regelmatig gedurende een periode van 30 minuten. Vervolgens gedurende 30 minuten centrifugue bij 3000 tpm.

Gooi het supernatant weg op een fenolische desinfecterende oplossing. Gebruik het zaaiende sediment, maar eerst moet de pH worden geneutraliseerd.

Om het sediment te neutraliseren, wordt h gebruikt₂SW₄ bij 5% in aanwezigheid van de rode fenol -indicator totdat deze leidt tot een neutrale pH die een zalmkleur voortkomt.

Maagwassen, bronchiaal wassen en bronchiale aspiratie

In dit geval moet het monster 30 minuten bij 3000 tpm worden gecentrifugeerd. Het supernatant wordt weggegooid en het sediment wordt gebruikt. Om het sediment te ontsmetten, wordt 3 ml 4% NaOH toegevoegd en vaak geroerd bij 37 ° C gedurende een periode van een half uur.

Kan u van dienst zijn: Stroma (histologie)

Weer centrifuge, het supernatant wordt weggegooid en het sediment wordt gebruikt. De laatste moet worden geneutraliseerd zoals uitgelegd in het sputum -monster.

Urine

Laat het monster 24 uur in de koelkast. Scheid de supernatant. Het resterende sediment moet 30 minuten worden gecentrifugeerd bij 3000 RMP. Gooi het supernatant opnieuw weg en reconsteer het sediment met 3 ml steriele fysiologische oplossing.

Voeg 3 ml 4% NaOH toe en ga verder met ontsmetting en neutralisatie zoals eerder beschreven.

Ascitische vloeistof, pleurale vloeistof, cerebrospinale vloeistof

In dit type monster wordt het gecentrifugeerd en wordt het supernatant weggegooid. Maak een gram naar het sediment of observeer rechtstreeks in de microscoop; Als bacteriën niet worden waargenomen, is de doorgang van ontsmetting niet nodig en noch de neutralisatie.

In dit geval kan het monster direct worden gezaaid met behulp van het sediment. Als er bacteriën zijn, ga dan verder met het decontamineren en neutraliseren zoals hierboven beschreven.

Biopsies

Dit type monster moet 5 ml gedestilleerd water worden toegevoegd aan latere centrifuge bij 1500 tpm gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en centrifugeer het sediment bij 3500 tpm gedurende 30 minuten. Gebruik het sediment om het kweekmedium te zaaien.

Hiophare larynx

Het wattenstaafje moet worden geïntroduceerd in een steriele buis die gelijke delen van gedestilleerd water en 4% NaOH bevat. Het wattenstaafje moet op de wanden van de buis worden gedrukt, zodat het monster in de vloeistof wordt verdund. Centrifuge en gebruik sediment. Neutraliseer het sediment zoals reeds beschreven.

Gezaaid

De Löwenstein-Jensen-media worden geïnoculeerd door 0,5 ml van het monster op het oppervlak van het medium toe te voegen. Draai de buis om het monster over het medium te verdelen. Draag geen platina -handvat.

U kunt een tweede buis zaaien met een halve stonebrink om te isoleren Mycobacterium bovis en andere soorten die niet groeien in de Löwenstein-Jensen-omgeving.

Incubatie

Geïnoculeerde buizen worden geïncubeerd in aerobiose bij 37 ° C, met een licht lui deksel en hellend bij ongeveer 5 ° en beschermd tegen licht. De omgeving met koolstofdioxide kan worden verrijkt met 5-10%. Controleer gewassen twee keer per week tot het verschijnen van kolonies.

Het kan u van dienst zijn: Nasal Exsudate: waar is het voor, procedure, teelt

Wanneer het monster is geabsorbeerd, worden de tapas aangepast. De maximale incubatietijd is 8 weken, als na deze tijd geen groei wordt gerapporteerd als negatief.

QA

Als kwaliteitscontrole kunt u de volgende stammen gebruiken:

Mycobacterium tuberculose ATCC 27294,  Mycobacterium Kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Voor de eerste drie genoemde soorten wordt een uitstekende ontwikkeling verwacht M. Fortuum Groei moet goed zijn, terwijl voor M. Bovis Schaarste of nul groei wordt verwacht. Terwijl, andere soorten dan het geslacht Mycobacterium moeten volledig worden geremd.

Beperkingen

Het voorbereide medium moet zichzelf beschermen tegen licht, langdurige blootstelling aan licht maakt het medium Vire van groen naar blauw, in dit geval kan het medium niet langer worden gebruikt. Dit komt omdat het groen van Malachite lichtgevoelig is.

Het medium, omdat het ei bevat, kan gemakkelijk worden vervuild als het niet aseptisch wordt gemanipuleerd. Het kan worden opgelost als het wordt besmet met proteolytische bacteriën.

De teelt en manipulatie van bacteriën van het geslacht Mycobacterium vereist gekwalificeerd personeel, dat zich bewust is van de bioveiligheidsmaatregelen die moeten worden vervuld om te voorkomen dat ze worden besmet of besmet.

HCl mag niet worden gebruikt bij de doorgang van neutralisatie vanwege de vorming van natriumchloride, die giftig kan zijn voor de Koch Bacillus.

Monsters moeten worden gekoeld en beschermd tegen licht zolang ze niet worden verwerkt.

Referentie

1. Laboratoria Francisco Soria Melguizo. 2009. Löwenstein-Jensen Selectief medium. Beschikbaar op: F-Soria.is
2. Britania Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen medium. Beschikbaar op: Britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen medium. Beschikbaar op: Foodsafety.Neogen.com.
4. "Midden van Löwenstein-Jensen." Wikipedia, gratis encyclopedie. 20 nov 2018, 15:15 UTC. 24 april 2019, 18:34. Wikipedia.borg
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e ed. Pan -Amerikaanse redactionele s.NAAR. Argentinië.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld a. (2009). Bailey & Scott microbiologische diagnose. 12 ed. Pan -Amerikaanse redactionele s.NAAR. Argentinië.
7. Mac Faddin J. (2003). Biochemische tests voor de identificatie van klinisch belang bacteriën. 3e ed. Pan -Amerikaans redactioneel. Buenos Aires. Argentinië.