DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) kenmerken, fundering, gebruik

Hij Dapi (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) Het is een kleurstof die door zijn fluorescerende eigenschap dient als een marker, die veel wordt gebruikt in de fluorescentie- of flowcytometrie -microscopietechniek, onder andere. De fluorescentie die het uitzendt is helderblauw, de opwinding vindt plaats tussen 455-461 nm (UV-licht).

De DAPI -kleurstof kan het celmembraan met groot gemak oversteken van dode cellen. U kunt ook levende celkernen verven, maar in dit geval moet de concentratie hiervan groter zijn.

Chemische structuur van fluorescerende dyst. Bron: Afbeelding: Bestand: DAPI.SVG is een vectorversie van dit bestand. Het moet worden gebruikt in plaats van dit rasterafbeelding wanneer niet Lower/Richard Wheeler (Zephyris) [CC BY-SA 3.0 (http: // creativeCommons.Org/licenties/by-sa/3.0/)] bewerkte afbeelding

De kleurstof is in staat om toegang te krijgen tot het cel -DNA waardoor hij een speciale affiniteit heeft, met grote aviditeit aan de adenine- en thymine stikstofbases. Om deze reden is het erg handig in sommige technieken van moleculaire biologie.

Deze verbinding behoort tot de groep indolische kleurstoffen en heeft aangetoond dat het een grotere gevoeligheid voor DNA heeft dan het ethidiumbromide en het fatidious jodide, vooral over agarosegels.

Het gebruik van deze fluorescerende kleurstof is zeer breed, omdat het nuttig is voor: het bestuderen van veranderingen in DNA in apoptotische processen (celdood) en daarom cellen in dit proces detecteren; voor DNA -voetafdrukfoto (fotografisch afdrukken van DNA); om bacteriële besmetting te bestuderen; o Om nucleaire segmentatie te visualiseren.

Het is ook gebruikt in de studie van chromosomale banden, bij de detectie van DNA van Mycoplasmas sp, In DNA-eiwit interactie, bij het kleuring en het tellen van cellen door immunofluorescentie en zelfs het kleuren van volwassen pollenkorrels.

[TOC]

Kenmerken

DAPI is de afkorting van zijn chemische naam (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). De moleculaire formule is c₁₆H_vijftienN_5. Het heeft een molecuulgewicht van 350.3. Nabij het UV-lichtbereik (345 tot 358 nm) Het maximale excitatie van het DAPI-ADN-complex vindt plaats, terwijl de maximale fluorescentie-emissie optreedt tussen 455-461 nm.

Deze kleurstof wordt gekenmerkt door een geel stof te zijn, maar de structuren gemarkeerd met deze fluorofoor stoten een helderblauw licht uit.

Het is echter een in water oplosbare verbinding om de oplossing te versnellen, kan sommige warmte worden toegepast. Het kan worden verdund met PBS, maar lost hier niet rechtstreeks op in.

Het kan u van dienst zijn: arseniosozuur (H3SO3): eigenschappen, risico's en gebruik

Zodra de kleurstof is voorbereid, moet deze worden opgeslagen in het donker, dat wil zeggen beschermd tegen licht, bij een temperatuur van 2 tot 8 ° C (koelkast). Onder deze omstandigheden is de kleurstof meer dan 3 weken of maanden stabiel.

Als het licht wordt beschermd maar de stabiliteit wordt achtergelaten bij kamertemperatuur tot 2 of 3 weken, maar blootgesteld aan direct licht, is de achteruitgang erg snel. Als u veel langer wilt sparen, kunt u in -20 ° C in porties gedistribueren in porties.

Basis

Deze kleur is gebaseerd op het genereren van een nucleaire aanwerving in de belangrijkste technieken van de moleculaire biologie, zoals: flowcytometrie, fluorescentiemicroscopie en kleuring van metafasische chromosomen of interface kernen, onder andere.

Deze techniek is gebaseerd op de grote affiniteit die de kleurstof heeft voor de stikstofbasen (adenine en timin) in het genetische materiaal (DNA) in de kleine groef. Terwijl op het cytoplasmatische niveau heel weinig bodem laat.

Wanneer de vereniging van de fluorescerende kleurstof naar de gebieden van adenine en timina van DNA optreedt, neemt fluorescentie aanzienlijk toe (20 keer meer). De kleur die het uitzendt is helderblauw. Opgemerkt moet worden dat er geen emissie van fluorescentie is bij het binden aan GC-basenparen (guanina-citosine).

Het is belangrijk om te benadrukken dat hoewel het ook een affiniteit heeft voor RNA, het geen probleem veroorzaakt, omdat de grotere mate van energie -emissie van dit molecuul optreedt tot een andere golflengte (500 nm), in tegenstelling tot het DNA dat het doet tot 460 nm. Bovendien is de toename van fluorescentie eenmaal gekoppeld aan RNA slechts 20%.

De DAPI wordt meer gebruikt om dode (vaste) cellen te verven die u leeft, want om de laatste te verven een veel hogere concentratie van de kleurstof is nodig, dit komt omdat het celmembraan veel minder permeabel is voor de DAPI wanneer het leeft.

De DAPI -kleurstof kan worden gebruikt in combinatie met rode en groene fluoroforen om een ​​veelkleurige ervaring te verkrijgen.

Gebruik

De DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) is een uitstekende fluorofoor en wordt daarom op grote schaal gebruikt in verschillende technieken en voor verschillende doeleinden. Het gebruik van DAPI wordt hieronder uitgelegd in de belangrijkste technieken.

Flowcytometrie

De onderzoekers Gohde, Schumann en Zante in 1978 waren de eerste die de DAPI voorstelden en voorstellen als een fluorofoor in de flowcytometrietechniek, met groot succes vanwege hun hoge gevoeligheid door DNA en de hoge intensiteit ervan in de emissie van fluorescentie.

Het kan u van dienst zijn: een aminogroep (NH2): structuur, eigenschappen, voorbeelden

Het gebruik van DAPI in deze techniek maakt de studie van de celcyclus, de kwantificering van cellen en de kleuring van levende en dode cellen mogelijk.

Hoewel er andere kleurstoffen zijn, zoals ethidiumbromide, Hoechst -oxide, acridine oranje en propidio -jodide, is de DAPI een van de meest gebruikte om meer foto te zijn dan die hierboven.

Voor deze techniek is het noodzakelijk. Het monster wordt gecentrifugeerd en het supernatant wordt weggegooid.

Terwijl de tijd de DAPI -kleurstof doorgeeft met een kleurbuffer (Foxp3 van Biolegend) tot een 3 µm.

Centrifugeer het monster, gooi het supernatant weg en bedek vervolgens 15 minuten met 1 ml DAPI -oplossing bij kamertemperatuur.

Neem het monster naar de flowcytometer met de rechter laser.

Flow microfluorometrie

Een andere techniek waarin de DAPI wordt gebruikt, is in de micro-fluorometrie van de stroom, samen met een andere fluorofoor genaamd Mitramical. Beide zijn nuttig om te kwantificeren.

Hybridisatie In situ 

Deze techniek gebruikt in principe DNA -sondes gemarkeerd met een fluorescerende kleurstof die de DAPI kan zijn.

Het monster vereist worden behandeld met warmte om het twee -klasse DNA te denaturaliseren en erin te veranderen in twee monocypenariumketens. Vervolgens wordt het gehybridiseerd met een DNAized DNA -sonde gemarkeerd met DAPI die een opeenvolging van interesse heeft.

Vervolgens wordt het gewassen om te elimineren wat niet hibrid was, een contrast wordt gebruikt om het DNA te visualiseren. De fluorescentiemicroscoop maakt de observatie van de gehybridiseerde sonde mogelijk.

Deze techniek is bedoeld om specifieke sequenties in chromosomaal DNA te detecteren, waardoor bepaalde ziekten kunnen diagnosticeren.

Deze cito-moleculaire technieken zijn nuttig geweest om details te bepalen in de studie van de karyotypes. Het heeft bijvoorbeeld de regio's aangetoond die rijk zijn aan paren van adenosine- en thyminebasen die heterochromatische gebieden of DAPI -banden worden genoemd.

Kan u van dienst zijn: permeabiliteit: concept, eenheden, factoren, voorbeelden

Deze techniek wordt veel gebruikt voor de studie van chromosomen en chromatine bij planten en dieren, evenals bij de diagnose van prenatale en hematologische pathologieën bij de mens.

In deze techniek is de aanbevolen DAPI -concentratie 150 ng/ml gedurende een tijd van 15 minuten.

De reeds gemonteerde dia's moeten worden beschermd tegen licht bij 2-8 ° C.

Kleuring van immunofluorescentie

De cellen zijn gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Als andere kleurstoffen zullen worden gebruikt, blijft DAPI aan het einde achter als aanwerving en zijn de cellen met PBS -oplossing gedurende 15 minuten bedekt. Terwijl de tijd verstrijkt, bereid je de DAPI -oplossing voor die verdunnen met PBS, zodat de uiteindelijke concentratie 300 µm is.

Dan wordt de overtollige PBS geëxtraheerd en 5 minuten bedekt met DAPI. Was meerdere keren. Het blad wordt waargenomen in een fluorescentiemicroscoop onder het juiste filter.

Veiligheidsblad

Deze verbinding moet zorgvuldig worden gemanipuleerd, omdat het een verbinding is met mutagene eigenschappen. Geactiveerde koolstof wordt gebruikt om deze verbinding van waterige oplossingen te elimineren die worden weggegooid.

Handschoenen, gewaad en beveiligingslenzen moeten worden gebruikt om ongevallen met dit reagens te voorkomen. Als er contact of slijmcontact optreedt, moet u het gebied wassen met voldoende water.

U mag nooit over dit reagens met uw mond pijp, gebruik Propipets.

Vervuil het reagens niet met microbiële agenten, omdat dit zal resulteren in foutieve resultaten.

Verdun de DAPI -kleurstof niet meer dan aanbevolen, omdat de kwaliteit van kleuring aanzienlijk zal afnemen.

Stel het reagens niet bloot om licht te sturen, of houd het warmte omdat het fluorescentie vermindert.

Referenties

1. Brammer S, Toniazzo C en Poersch L. Gewoonlijk ondergebrachte cholars na groente cytogenetica. Arq. Instrumenten. Biol. 2015, 82. Beschikbaar van: Scielo.
2. Impath Laboratories. Dapi. Beschikbaar bij: Menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratories. 20199999999999999999999999999999999999999111 2019 2019 20199999 E moetene9999191999998311133113331322111152222222111231311111111111122111111111121111111111111111111111111111 -11111111111a's11111a's1a's1a's1a's1a's1a's D1a's Dam dat ’TO. Instructies voor het gebruik van DAPI. Beschikbaar bij Cycell.com
4. Elaosegi A, Sabater S. Concepten en technieken in rivierecologie. (2009). Redactionele rubes, Spanje. Beschikbaar bij: boeken.Google.co.gaan/
5. Novaes R, Penitent A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Gebruik van fluorescentie in een gemodificeerde dissector -methode om het aantal myocyten in het hartweefsel te schatten. Arq. Beha. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Beschikbaar van: Scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Aanwezigheid van fytoplasma's in Papayo (Carica Papaya) in Mexico. Chapingo Magazine. Tuinbouwreeks, 2011; 17 (1), 47-50. Beschikbaar bij: Scielo.borg.