Gram kleuring

Gramkleuring is handig voor het visualiseren van verschillende soorten bacteriën

Wat is de vlekken van Gram?

De Gram kleuring Het is de eenvoudigste en meest bruikbare kleuringstechniek in diagnostische microbiologie om bacteriën te identificeren. Deze techniek is gemaakt door de Deense dokter Christian Gram in 1884, die bacteriën in gram -positief (paars) en gram -negatief (roze) classificeerde, volgens de samenstelling van de celwand.

De techniek leed in 1921 bepaalde wijzigingen door Hucker om reagentia te stabiliseren en de kwaliteit van kleuring te verbeteren, dus de kleuring van Gram staat ook bekend als gram-hucker.

Met deze techniek is het ook mogelijk. Evenals zijn verdeling in de ruimte: in het cluster, in keten, geïsoleerd, in paren, in tetrads, enz.

Basis

Het is een techniek die 4 fundamentele stappen presenteert: kleuring, repareren met de mordant, verkleuring en aanwerving. Daarom kunt u, naast het kleuren van bacteriën, ook differentiëren.

Violet Crystal is de eerste kleurstof die wordt gebruikt. Hetzelfde heeft een affiniteit voor de peptidoglycan en zal alle aanwezige bacteriën verven, vervolgens de lugol geplaatst, die als een mordant werkt, dat wil zeggen dat het de vorming van onoplosbare complexen van violet glas/jodium/ribonucleaire eiwitten in de cel zal induceren.

Gram -positieve bacteriën, met een dikke peptidoglycanwand, vormen complexer (violet/jodiumglas), daarom zullen ze paars worden geverfd.

Het beïnvloedt ook dat de wand van gram -positieve bacteriën meer onbewonderde zuren bevat, die grote affiniteit vertonen voor oxidatiemiddelen (Lugol).

Gram -negatieve bacteriën hebben een dunne cape peptidoglycan, waardoor bacteriën minder complex zijn dan gram -positief.

Vervolgens komt de stap van verkleuring, waarbij gram -positieve en gram -negatieve bacteriën zich anders gedragen.

Gram -negatieve bacteriën bevatten een buitenmembraan dat rijk is aan lipopolysachariden die deel uitmaakt van zijn celwand. Vetten worden vernietigd door contact met acetonalcohol, dus het externe membraan is gedestabiliseerd, het violette glas wordt vrijgegeven.

Dit is hoe het later wordt aangenomen met de basis Safranine of Fuchsin, die de rode kleur neemt.

In het geval van gram -positieve bacteriën weerstaan ​​ze de verkleuring omdat het bleekmiddel werkt door de poriën te sluiten, waardoor het violette kristalcomplex/jodium niet kan uitkomen.

Daarom is kleuring met het violette glas stabiel en er is geen plaats voor safranine of fuchsin. Daarom zijn deze bacteriën intens of paars geverfd.

Materialen

Gram's kleurset bestaat uit:

- Violetglas.

- Lugol.

- Acetonalcohol.

- Basic safranine of fuchsin.

Bereiding van kleurstoffen en reagentia

Violet Crystal -oplossing

Oplossing voor:

Violet Crystal - 2 Gr

95% - 20 cc ethylalcohol

Oplossing B:

Ammoniumoxalaat - 0.8 gram

Gedistilleerd water- 80 cc

Voor de uiteindelijke bereiding van het violette glas moet de oplossing tot 1:10 worden verdund met gedestilleerd water en mengen met 4 delen van oplossing B. Het mengsel wordt 24 uur bewaard voordat u het gebruikt. Het wordt gefilterd in een amberkleurige fles met behulp van een papieren filter.

Het kan u van dienst zijn: Chiapas Flora en Fauna: representatieve soorten

De dagelijkse hoeveelheid wordt verplaatst naar een barnsteenfles met druppelaar.

Jodium-lugol

Weeg en meet de aangegeven hoeveelheid van elke verbinding, als volgt:

Jodiumkristallen - 1 gram

Kaliumjoduro - 2 gram

Gedestilleerd water - 300 cc

Het kaliumjodide wordt beetje bij beetje in het water opgelost en vervolgens wordt het jodium toegevoegd. De oplossing voor een barnsteenfles wordt overgebracht.

De dagelijkse hoeveelheid wordt verplaatst naar een kleinere barnsteenfles met druppelaar.

Verhandelaar

95% ethylalcohol - 50 ml

Aceton - 50 ml

Het wordt in gelijke delen voorbereid. Dek goed, omdat het de neiging heeft om te verdampen.

Bottero in fut.

Deze voorbereiding biedt een matige tijdverkleuring 5-10 sec., En het is het meest aanbevolen.

Beginers gebruiken liever slechts 95%ethylalcohol, waarbij de verkleuring langzamer is, van 10 tot 30 seconden.

Hoewel de meest ervaren pure aceton kan gebruiken, waar verkleuring zeer snel optreedt van 1 tot 5 seconden.

Contrast

Safranine moederoplossing

Safranine - 2.5 gram

95%ethylalcohol - 100 cc

Na het wegen van de aangegeven hoeveelheid safranine, lost het op bij 100 cc ethylalcohol bij 95%.

Uit de moederoplossing wordt de werk Safranine -oplossing bereid.

Om dit te doen, meet 10 cc van de moederoplossing, voeg 90 cc gedestilleerd water toe om 100 ml te voltooien.

Het wordt aanbevolen om het bedrag dat dagelijks wordt gebruikt over te dragen naar een barnsteenfles met druppel.

Micro-organismen die zwak worden geverfd met de kleuring van Gram-Hucker, als bepaalde anaëroben, Legionella SP, Campylobacter SP En Brucella SP, Ze kunnen veel beter worden gekleurd als de aanpassing van Kopeloff aan de kleuring van gram-hucker, gram-karoff kleuring gemaakt.

Deze techniek verandert de safranine -kleurstof voor basis fuchsin. Met deze aanpassing is het mogelijk om de bovengenoemde micro -organismen effectief te kleuren.

Reagensopslag

Bereide kleurstoffen moeten worden bewaard bij kamertemperatuur.

Bereiding van het uitgebreide monster op kleur

Een monster moet minimaal 10 bevatten⁵ Micro -organismen vóór de observatie zijn waarschijnlijk in een uitstrijkje. Uitgebreide kunnen worden uitgevoerd vanuit het directe monster of gewassen in vaste of vloeibare media.

De uitgebreide moeten uniform zijn, goed verdeeld en niet erg dik, voor een betere visualisatie van de aanwezige structuren.

Gram van directe monsters

Gram urine zonder centrifugeren

Urine wordt gemengd en 10 µl wordt op een dia geplaatst. De observatie van ten minste één bacterie/onderdompelingsveld geeft aan dat er een infectie is.

Dit betekent dat het gewas ongeveer meer dan 100 zal hebben.000 UFC/ml (10⁵ UFC/ml) urine in 85% van de gevallen.

Deze methode is niet nuttig voor koloniale tellingen onder de 100.000 UFC.

Gram van CSF

De CSF moet centrifuge zijn, het supernatant wordt verwijderd en het sediment strekt zich uit in een dia. Deze vloeistof is steriel onder normale omstandigheden. Bacterieobservatie duidt op infectie.

Kan u van dienst zijn: zoutklieren

Gram van ademhalingsmonsters

Het sputum gram, bronchiale of broncoalmolaire wassen, hoewel er mogelijk een verscheidenheid aan micro -organismen is, zal het altijd de diagnose begeleiden, naast het bruikbaar is het type cel waargenomen.

In het geval van Esputo moet de uitgebreide met de meest etterende delen van het monster worden voorbereid.

Uitwerpselen gram

Het is niet raadzaam om gram te maken voor dit type monsters, omdat het geen diagnostische waarde heeft.

Gram gewassen

Ze kunnen op twee manieren worden gedaan, een van vloeibare gewassen en een andere van vaste gewassen.

Vloeibare gewassen

Uit vloeibare gewassen is het uiterst eenvoudig: onder de lichtere worden verschillende braadstukken van de duistere bouillon genomen en op een schone en droge dia geplaatst, waardoor cirkelvormige bewegingen van het midden naar de periferie krijgen, om het materiaal gelijkmatig te verdelen.

Het is spontaan toegestaan ​​om te luchten. Eenmaal droog, wordt het materiaal met warmte op het vel bevestigd. Om dit te doen, met behulp van een klem passeer je het laken 3 tot 4 keer door de vlam van het bunsenen lichtere, zorgvuldig om het materiaal niet te verbranden.

Het blad mag afkoelen en op de kleurbrug geplaatst.

Stevige gewassen

Ga als volgt om een ​​uitgebreide gramkleuring uit een vast gewas uit te voeren:

Voordat u de te nemen kolonies kiest, moet u het slotlam voorbereiden en ongeveer twee druppels steriele fysiologische zoutoplossing plaatsen.

Als de originele teeltplaat verschillende soorten verschillende kolonies bevat, wordt een geïsoleerde kolonie van elk gekozen om de gram uit te voeren. Elke kolonie wordt genomen met de platinakend om deze op te lossen in de zoutoplossing die eerder op de dia is geplaatst.

Circulaire bewegingen worden gegeven van het midden tot de periferie, om de kolonie homogeen in de dia te verdelen.

Het is spontaan toegestaan ​​om te luchten. Eenmaal droog, wordt het vel gefixeerd met warmte, zoals hierboven uitgelegd (vlammen de slotsleuf met de lichter), waardoor het materiaal niet wordt verbrand.

Deze procedure moet worden uitgevoerd met elk ander type kolonie. De volgorde van wat wordt waargenomen, bijvoorbeeld:

Colonia 1: Betahemolytische gele kolonia: gram -positieve kokosnoten werden waargenomen in clusters.

Colonia 2: Cream Colonia, zonder hemolyse: gramnegatieve cocobacilli werden waargenomen.

Elk blad moet worden gelabeld om te weten wat we waarnemen.

Techniek

De kleurtechniek van Gram is uiterst eenvoudig uit te voeren en relatief economisch en kan niet ontbreken in een laboratorium voor microbiologie.

Het wordt als volgt gedaan:

1. Zet het uitstrijkje met warmte en plaats op de kleurbrug.
2. Het vel is volledig bedekt met violette glas na 1 minuut.
3. Was met water. Droog niet.
4. Bedek het vel met Lugol -oplossing, laat 1 minuut handelen. Was met water. Droog niet.
5. Versier 5-10 seconden met zachte agitatie in acetonalcohol. O Plaats het vel verticaal en laat ontkleurende druppels op het oppervlak vallen totdat het de reserve van Violet Crystal sleept. Niet overschrijden.
6. Was met water. Droog niet.
7. Plaats het vel op de kleurbrug en dek af bij 30 sec met Safranine (gram-hucker) of 1 min met eenvoudige fuchsina (gram-kopeloff).
8. Was met water.
9. Spontaan in de lucht in verticale positie laten vallen.

Het kan je van dienst zijn: flora en fauna

Eenmaal droog, plaats 1 druppel onderdompelingolie om het te observeren onder het doel van 100x in de optische microscoop.

Gebruik/toepassingen van gramkleuring

- Deze techniek maakt het mogelijk om de morfotintoriële verschillen van de meeste bacteriën te onderscheiden.

- Gisten worden ook onderscheiden met deze kleuring. Ze nemen het violette glas, dat wil zeggen, ze zijn geverfd gram -positief.

- Je kunt gram -positieve sporen bacillen onderscheiden, waar een duidelijke ruimte wordt waargenomen in de bacil waar de endospora werd gevormd, hoewel de sporen niet goed zijn bevlekt. Om sporen te verven, worden andere technieken gebruikt, zoals Shaeffer-Fulton.

- Helpt bij het bepalen van het type antibioticum dat moet worden voorbereid.

Opgemerkt moet worden dat deze kleuring Het werkt niet Om alle soorten bacteriën te kleuren, dat wil zeggen dat er gevallen zijn waarin kleuring niet werkt.

In deze gevallen kunnen bacteriën die een celwand missen worden genoemd. Bijvoorbeeld: geslacht Mycoplasma, sferoplast, Ueplasma, L vormen en protoplasten.

Bovendien zijn bacteriën met bacteriën die rijk zijn aan mycolische zuren, zoals mycobacteriën en intracellulaire bacteriën, zoals chlamydia's en rickettsia's.

Het is ook niet effectief om de meeste spirochemale bacteriën te verven.

Er zijn bacteriën van hetzelfde geslacht die kunnen worden waargenomen in hetzelfde monster als gram -positief en als gramnegatief. Wanneer dit gebeurt, wordt het de variabele gramkleuring genoemd, die kan te wijten zijn aan verandering in voedingsstoffen, temperatuur, pH of elektrolytconcentratie.

Veelgemaakte fouten

Overdreven versieren

Overdrijven in de verkleuringspas kan de observatie van valse gram -negatieve micro -organismen veroorzaken.

Wacht niet op voldoende droogtijd om de onderdompelingolie toe te voegen

Deze fout zorgt ervoor dat vetmicels worden gevormd die de observatie van de aanwezige structuren belemmeren. Dit gebeurt wanneer de olie zich aansluit bij de watermoleculen die aanwezig zijn in de geur.

Investeer de volgorde van reagentia

Een fout als deze zal gram -negatieve bacteriën genereren die moeten worden gevisualiseerd, dat wil zeggen valse grampositief.

Gebruik oude gewassen (vaste stoffen of vloeistoffen)

Het kan ervoor zorgen dat gram -positieve bacteriën gram -negatief bevlekken (gram -negatief onwaar). Dit gebeurt omdat het in oude gewassen waarschijnlijk is dat er dode of verslechterde bacteriën zijn, en onder deze omstandigheden behouden de bacteriën het violette glas niet.

Gebruik een zeer oude Lugol -oplossing

In de loop van de tijd verliest Lugol zijn eigenschappen en vervaagt de kleur. Als het reeds gedegenereerde reagens wordt gebruikt, zal dit het violette glas niet goed oplossen, daarom is er een mogelijkheid om een ​​visualisatie van vals gram -negatieve micro -organismen te verkrijgen.

Blauwe achtergrond

Een goed verkleurde achtergrond is rood. Een blauwe achtergrond geeft aan dat de verkleuring onvoldoende was.

Referenties

1. Huizen-rincón, g. (1994). Algemene mycologie. Centrale Universiteit van Venezuela.
2. Gram kleuring. Uit genomen.Wikipedia.borg.
3. González, m., González, n. (2011). Medical Microbiology Manual. Directoraat media en publicaties van de Universiteit van Carabobo.