Technisch recombinant DNA, toepassingen en fundamentals

Hij Recombinant DNA (DNA of rDNA) is een kunstmatig nucleïnezuurmolecuul dat in het laboratorium is gecreëerd, door twee interesse segmenten te integreren. Het is ook bekend als chimeer DNA, dankzij zijn hybride eigenschap. We vinden dit type DNA niet in de natuur.

De basismethode om het te genereren omvat: (a) de selectie van een wit DNA en de invoeging ervan in een ander DNA -fragment (in het algemeen een bacterieel plasmide); (b) De introductie van dit plasmide in een bacterie, (c) de selectie van bacteriën door antibiotica en uiteindelijk (d) de expressie van het gen.

Bron: Pixabay.com

De techniek maakt gebruik van een enzymspel waarmee u specifieke DNA -fragmenten kunt kopiëren en plakken naar de proef van de onderzoeker.

Het doel van recombinante technologie is in de meeste gevallen de expressie van een eiwit (bekend als recombinant eiwit) gewenst door de moleculaire bioloog voor toekomstig onderzoek of om een ​​eiwit van commerciële en therapeutische waarde te creëren - zoals menselijke insuline, bijvoorbeeld.

[TOC]

Fundamentals van de recombinante DNA -techniek en het gebruik ervan in genetische manipulatie

Het centrale dogma van de moleculaire biologie

Alle organische wezens die we kennen delen verschillende kenmerken. Een van hen is de aard van genetisch materiaal en de manier waarop eiwitten worden geproduceerd - proces bekend als het centrale "dogma" van moleculaire biologie.

Met uitzondering van een paar virussen, slaan alle organismen genetische informatie op in DNA (deoxyribonucleïnezuur), zeer compact verzameld en georganiseerd in de celkern.

Voor genexpressie wordt het DNA -molecuul getranscribeerd naar het RNA van de boodschapper en wordt de laatste vertaald in aminozuurtaal, de structurele blokken van eiwitten.

Wat is een recombinant DNA?

Tussen de jaren 70 en 80 begonnen moleculaire biologen te profiteren van de processen die van nature in de cel voorkomen en slaagden erin ze te extrapoleren naar het laboratorium.

Op deze manier kan een diergen (bijvoorbeeld een gewervelde dieren) worden ingevoegd in een DNA -segment uit een bacterie; of het DNA van een bacterie kan worden gecombineerd met een viraal DNA. Aldus kunnen we een recombinant DNA definiëren als een molecuul bestaande uit DNA uit twee verschillende organismen.

Zodra dit hybride of recombinante molecuul is gecreëerd, gaan we verder met de expressie van het belangengen. Met het woord uitdrukking We willen verwijzen naar het eiwittranslatieproces.

Kan je van dienst zijn: monohíbrid

Beperking en competities enzymen: de sleutel tot het proces

Een belangrijk element om recombinante DNA -technologie te ontwikkelen was de ontdekking van restrictie -enzymen.

Dit zijn eiwitmoleculen die het vermogen vertonen om te splitsen op DNA (nucleas) in betonsequenties, die dienen als "moleculaire schaar". De fragmenten die door deze enzymen worden gegenereerd, worden restrictiefragmenten genoemd.

Deze enzymen kunnen produceren in de witte sequentiesymmetrische sneden (in beide ketens op dezelfde hoogte) of asymmetrische sneden. Een belangrijk aspect van de werking van restrictie -enzymen is dat na het splitsen van de ketens een "losse rand" wordt verkregen, complementair aan de andere rand gesneden door hetzelfde enzym.

Sommige voorbeelden zijn ECOR 1 en SMA 1. Meer dan 200 soorten restrictie -enzymen zijn momenteel bekend en ze zijn commercieel beschikbaar.

Om nuttig te zijn, moet een schaar vergezeld gaan van de lijm. Deze DNA -afdichtingsactie (eerder behandeld met restrictie -enzymen) wordt uitgevoerd door competities.

Techniek: hoe is het DNA van een organisme in het laboratorium kunstmatig aangepast?

Vervolgens zullen we de belangrijkste stappen beschrijven die nodig zijn door recombinante DNA -technologie. Allen worden uitgevoerd door professionals in een laboratorium voor moleculaire biologie.

Wat is een "kloon"?

Voordat we doorgaan met het experimentele protocol, moeten we opmerken dat in moleculaire biologie en biotechnologie de term "kloon" en het werkwoord "klonar" veel worden gebruikt. Dit kan tot verwarring leiden.

In deze context verwijzen we niet naar het klonen van alle Een organisme (zoals in het geval van de beroemde dolly -schapen, bijvoorbeeld), maar voor het klonen van een DNA -fragment, dat een gen kan zijn. Dat wil zeggen, produceren veel kopieën - genetisch identiek - van de sequentie.

1. Isolatie en het verkrijgen van DNA

De eerste stap is om te beslissen welke volgorde wil worden gebruikt. Dit hangt volledig af van de onderzoeker en de doelstellingen van zijn werk. Dan moet dit DNA worden geïsoleerd en gezuiverd. De methoden en procedures om dit te bereiken zijn afhankelijk van het organisme en het weefsel.

Een deel van het weefsel wordt in het algemeen genomen en ondergaat een behandeling in een lysisliefhebber. Vervolgens wordt de fragmentatie van genetisch materiaal in kleine fragmenten voortgezet.

2. Kloningsvector

Na de voorbereidende stappen wil de onderzoeker het DNA -segment van interesse in een kloneringsvector introduceren. Vanaf nu naar dit DNA -segment zullen we het wit DNA noemen.

Het kan u van dienst zijn: Dominant Gen: genetische principes, onderzoeksmethoden, factoren

Plasmiden

Een van de meest gebruikte vectoren in een plasmide van bacteriële oorsprong. Een plasmide is een tweepersoonsketencirculair DNA -molecuul dat we op natuurlijke wijze vinden in bacteriën. Het zijn entiteiten buiten het bacteriële chromosoom - dat wil zeggen, ze zijn extracromosomaal en worden natuurlijk aangetroffen in deze prokaryoten.

De basiselementen van een vector zijn: (a) een oorsprong van replicatie, die DNA -synthese mogelijk maakt; (b) selectiemiddel, waardoor organismen kunnen identificeren die het plasmide met wit DNA dragen, zoals resistentie tegen een antibioticum; en (c) multiclonatieplaats, waarbij de sequenties die zullen worden herkend door restrictie -enzymen worden gevonden.

Het eerste succesvolle recombinante DNA in het laboratorium werd gekloneerd in het PSC101 -plasmide van de bacteriën EN. coli. Dit bevat een restrictieplaats voor het ecori -restrictie -enzym en een resistentiegen tegen een antibioticum, naast de oorsprong van de replicatie.

De invoeging van het witte DNA in het plasmide wordt gedaan met behulp van de moleculaire hulpmiddelen van restrictie -enzymen en competities beschreven in de vorige sectie.

Substant soorten vectoren

Naast de plasmiden kan het DNA worden ingebracht in een andere vector, zoals de lambda -bacteriofaag.

3. Introductie van recombinant DNA

Zodra het recombinante DNA -molecuul (gen van belang in het plasmide of andere vector) is verkregen.

Om buitenlands DNA in een bacterie te introduceren, wordt een techniek genaamd bacteriële transformatie gebruikt, waarbij het lichaam wordt onderworpen aan een behandeling met tweewaardige kationen die het vatbaar maakt voor het nemen van DNA.

Methodologisch kunnen we niet ervoor zorgen dat 100% van de bacteriën in ons gewas onze recombinante DNA -molecuul effectief hebben ingenomen. Dit is waar het deel van het plasmide dat antibioticaresistentie bevat, in het spel komt.

Aldus zullen bacteriën die het plasmide hebben ingenomen resistent zijn tegen een bepaald antibioticum. Om ze te selecteren, zal het voldoende zijn voor de toepassing van genoemde antibioticum en de overlevenden nemen.

4. "Oogst" eiwit

Na het selecteren van bacteriën met ons recombinant DNA, gaan we verder met het gebruik van de enzymatische machines van de gastheer om het eiwitproduct van interesse te genereren. Naarmate bacteriën worden gereproduceerd, gaat het plasmide door naar zijn nakomelingen, dus het gaat niet verloren tijdens de divisie.

Deze procedure gebruikt bacteriën als een soort "fabriek" van eiwitten. Later zullen we zien dat het een zeer relevante procedure is geweest bij de ontwikkeling van effectieve medische behandelingen.

Kan u van dienst zijn: Telophase: wat is in mitose in meiose

Zodra het gewas klaar is en de bacteriën grote hoeveelheden eiwitten hebben geproduceerd, is de cel of breuk van de cel. Er is een breed scala aan biochemische technieken die eiwitzuivering mogelijk maken volgens hun fysiek-chemische kenmerken.

In een andere experimentele context zijn we misschien niet geïnteresseerd in het genereren van eiwitten, maar we zijn geïnteresseerd in het verkrijgen van de DNA -sequentie per se. Als het het geval was, zou het plasmide dienen voor het creëren van meerdere kopieën van het fragment dat ons interesseert met als doel voldoende hoeveelheid van het witte DNA te hebben om de relevante experimenten uit te voeren.

Toepassingen

De recombinante DNA -technologie opende een oneindig aantal mogelijkheden voor moleculaire biologie, biotechnologie, geneeskunde en andere gerelateerde gebieden. Uw meest uitstekende toepassingen zijn de volgende.

Genetische analyse

De eerste toepassing is direct gerelateerd aan moleculaire biologielaboratoria. Met recombinante DNA -technologie kunnen onderzoekers de normale functie van genen begrijpen en gegenereerde eiwitten kunnen in het daaropvolgende onderzoek worden gebruikt.

Farmaceutische industrie

Eiwitten geproduceerd met behulp van de recombinante DNA -procedure hebben toepassingen in de geneeskunde. Twee zeer relevante voorbeelden in het veld zijn menselijke insuline en groeihormoon, dat wordt toegepast bij patiënten die dergelijk eiwit missen.

Dankzij recombinant DNA kunnen deze eiwitten worden gegenereerd zonder de noodzaak om uit een ander mens te extraheren, wat aanvullende methodologische complicaties en gezondheidsrisico's vertegenwoordigt. Dit heeft geholpen de kwaliteit van leven van talloze patiënten te verbeteren.

Referenties

1. Baca, l. EN. L., & Álvarez, c. L. C. (2015). Biologie 2. Patria -redactiegroep.
2. Cooper, G. M., Hausman, r. EN., & Hausman, r. EN. (2000). De cel: een naderingsmoleculair (Vol. 10). Washington, DC: ASM Press.
3. Devlin, T. M. (2004). Biochemie: leerboek met klinische toepassingen. Ik heb omgekeerd.
4. Khan, s., Ullah, m. W., Siddique, r., Nabi, g., Manan, s., Yousaf, m., & Hou, h. (2016). Rol van recombinante DNA -technologie om het leven te verbeteren. International Journal of Genomics, 2016, 2405954.
5. Mindan, f. P., & Mindan, p. (1996). Pathologische anatomie. Elsevier Spanje.
6. Tortora, g. J., Funke, B. R., & Case, c. L. (2007). Inleiding tot microbiologie. ED. Pan -American Medical.
7. Hen. J. (1989). Menselijke insuline: het eerste medicijn van DNA -technologie. American Journal of Health-System Pharmacy, 46(11_suppl), S9-S11.