Proteinase K -kenmerken, enzymatische activiteit, toepassingen

De proteina k Het is een enzym dat behoort tot de groep serineproteasen, dat wil zeggen dat het in zijn actieve katalytische centrum een ​​serine -aminozuur heeft en de functie heeft om de peptidebindingen door hydrolyse te verbreken door hydrolyse. Op zijn beurt behoort dit enzym tot de familie van subtilisine -eiwitten (peptidase S8).

Het K -proteïnase heeft een molecuulgewicht (PM) van 28.900 Daltons en werd voor het eerst geïsoleerd in 1.974 in schimmeluittreksels Engyodontium album, eerder bekend als de naam van Tritirachium -album Limber.

Moleculaire structuur van het K -proteïnase. Bron: Lykchiniadis [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/licenties/by-sa/4.0)]

Het presenteert een hoge proteolytische capaciteit, aangetoond door de keratine in het haar te kunnen afbreken. Het woord keratin in het Engels is geschreven "keratin", van daar komt het dat het "eiwinsa k" wordt genoemd.

Vanwege het hoge vermogen om natieve eiwitten te splitsen, is dit enzym nuttig in verschillende technieken van moleculaire biologie. Voornamelijk gebruikt om nucleïnezuren te isoleren en te bereiden met een hoog molecuulgewicht (PM).

Het K -proteïnase werkt door het nucleaire DNA vrij te geven, terwijl het eiwitten vernietigt en inactief is voor RNases en Dnate, dat wil zeggen nucleas in DNA- en RNA -preparaten elimineert.

Aan de andere kant is gezien dat K -proteïnase sommige gedenatureerde natieve eiwitten kan hydrolyseren, die de interesse van onderzoekers hebben gemaakt voor gebruik in de studie van Prion -eiwitten (PRPC).

Ondanks zijn hoge proteolytische kracht zijn er echter eiwitten die resistent zijn tegen de werking van K -eiwit. Onder hen zijn er enkele afwijkende eiwitten genaamd Prions (PRPSC), geassocieerd met overdraagbare spongiforme encefalopathieën.

[TOC]

Kenmerken van het proteïnase K

Het K -proteïnase heeft een tertiaire structuur bestaande uit drie lagen, met een β -vel van zeven medische ketens tussen twee lagen propellers. Voor het behoren tot de familie van peptidasen wordt S8 gekenmerkt door een katalytische triade te presenteren in zijn actieve site, waarvan de opeenvolgende volgorde is (ASP, His and Being), die hen onderscheidt van andere peptidasefamilies.

Het kan u van dienst zijn: eiwitaminozuren

Dit enzym van de serineproteasegroep wordt gekenmerkt door hydrolyserende peptidebindingen dicht bij de carbonische groep alifatische en aromatische aminozuren.

Aan de andere kant is het in staat om te werken in aanwezigheid van bepaalde corrosieve stoffen, zoals natriumdodecilsulfaat (SDS), Tris-HCl en EDTA, die worden gebruikt om de denaturatie van eiwitten te helpen, waardoor ze hun native structuur verliezen.

Dit is een eerdere stap in de bereiding van eiwitten voor de elektroforese -techniek. Het pH -bereik waartoe de k -eiwinsa werkt, is vrij breed (2.0 tot 12.0), met een optimale pH tussen 7.5 tot 12.0, en het iso -elektrische punt is 8.9. Zoals te zien is, is het actief tegen een zeer breed scala aan pH.

Een ander kenmerk dat opvalt in het K -proteïnase is de stabiliteit in aanwezigheid van hoge temperaturen (50 - 60 ° C).

Enzymatische activiteit

De K -eiwinsa heeft de aanwezigheid van calciumion nodig, hoewel het geen invloed heeft op zijn activiteit, als het essentieel is om zijn stabiliteit te behouden.

Voor de K -eiwinsa om de volledige spijsvertering van het substraat uit te voeren, is een geschatte contacttijd nodig tussen 5 minuten tot 2 uur.

In deze zin vergeleken Daza en medewerkers echter de zuiverheid van het DNA verkregen bij verschillende blootstellingstijden tegen het K -proteïnase en concludeerde dat een langdurige incubatie (tot 24 uur) de kwaliteit van het DNA aanzienlijk verbetert.

Nu, in relatie tot de concentratie die wordt gebruikt van het K -proteïnase -enzym in de verschillende protocollen, kan worden gezegd dat het zeer gevarieerd is.

Het kan worden gebruikt uit zeer lage concentraties (5 µg/ml) tot 500 µg/ml concentraties. Maar de meest voorkomende werkconcentraties variëren tussen 50-100 μg /ml, vooral voor eiwitvertering en nucleas. Hoewel voor weefselbehandeling een concentratie van 2 mg/ml vereist is.

Kan u van dienst zijn: easmotherium sibiricum: kenmerken, habitat, fossielen

Toepassingen

Hun toepassingen zijn erg breed en kunnen in het volgende worden samengevat:

-Het wordt gebruikt in eiwitvertering en DNA-extractie door verschillende methoden zoals: Salting-out, PK-SD's, cethyltetylammonium (CTAB), gemodificeerd kaliumacetaat en natriumjodide-extractie acetaat acetaat acetaat.

-Inactivering van nucleasas (RNASA's en DNASA's).

-In de hybridisatietechniek In situ (Zijn), om de afgifte van nucleïnezuur te helpen, naast het elimineren van ongewenste eiwitten.

-Eiwitaanpassing.

-Op onderzoeksniveau, in verschillende onderzoeken.

Voordelen van K -proteïnase

Verschillende vergelijkende studies zijn uitgevoerd tussen DNA -extractietechnieken die K -proteïnase gebruiken, met anderen die het niet gebruiken en allemaal concluderen dat er grotere voordelen zijn wanneer het enzym wordt gebruikt. Onder de voordelen kan het volgende worden vermeld:

-Hoog moleculair, hoge kwaliteit en zuiverheid DNA wordt verkregen.

-Het geëxtraheerde DNA is maximaal 3 maanden stabiel.

DNA geëxtraheerd kan worden gebruikt in de volgende technieken: Southern blot, polymerasekettingreactie (PCR), elektroforese, onder andere.

Proteinase resistent K -eiwitten

Verschillende onderzoeken hebben geconcludeerd dat prionen (toxische PRPSC -anomale eiwitten verschillen van PRPC (native) eiwitten door resistent te zijn tegen de werking van K -proteïnase, terwijl PRPC's gevoelig zijn voor hun actie.

Andere auteurs hebben beschreven dat er in de structuur van PRPSC gevoelige delen zijn en andere resistent tegen het K -proteïnase. Beide partijen zijn echter even giftig en besmettelijk.

Aan de andere kant geïsoleerde Bastian en medewerkers in 1987 4 eiwitten van 28, 30, 66 en 76 kDa van een soort van een soort Spiroplasma mirum. Alles bleek resistent te zijn tegen de werking van het K -proteïnase en hadden ook een kruisreactie met enkele prionen.

Kan u van dienst zijn: chemotoxis

Het is bekend dat deze soort belangrijke cataract en neurologische schade kan veroorzaken en vanwege de wetenschappelijke bevindingen van Bastian, naast andere onderzoek, heeft het geprobeerd zich te verhouden tot dit micro -organisme met overdraagbare spongiforme encefalopathieën overdraagbaar.

De etiologie van deze degeneratieve neurologische pathologie blijft echter momenteel toegeschreven aan prionen.

In die zin identificeerden en karakteriseerden Butler en medewerkers in 1991 een klasse van een 40 kDa KDA -proteïnase -resistent uit twee stammen uit twee stammen van Mycoplasma hyorhinis. Deze pathogeen beïnvloedt varkens, die hun weefsels infecteren, maar in dit geval was er geen kruisreactie met de geteste gevangenissen.

Meer onderzoek is vereist om in dit opzicht veel onbekenden op te helderen.

Referenties

1. Bastian F, Jennings R en Gardner W. 1987. Antiserum tegen scrapie-asociated fibril-eiwit kruisreacties met Spiroplasma miruM Fibril -eiwitten. J. Klin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Evaluatie van een DNA -extractie- en zuiveringsmethode uit spierweefsel gefixeerd in de formaldehyde van niet -geïdentificeerde lijken.  Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E en McGarrity G. Identificatie en karakterisering van eiwit K-resistente eiwitten bij leden van de klasse mollicutes.  Infectie en immuniteit, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Marokoima A, Herrera L, et al. Vergelijking van twee DNA -extractieprotocollen van Trypanosoma cruzi Gecultiveerd in axhenisch medium. Revisie. Peru. Med. Exp. Volksgezondheid  2014; 31 (2): 222-227. Beschikbaar bij: Scielo.borg
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E en Palma W. Bepaling van de effectiviteit van vijf DNA -extractieprotocollen uit parafined materiaal voor moleculaire studies. Rev Méd Medic Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.